Анализ мультимодальных возмущений циклина

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 7678 (2023) Цитировать эту статью

861 Доступов

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Контроль клеточного цикла осуществляется с помощью циклин-зависимых киназ (CDK), что мотивирует обширные исследования CDK, нацеленные на низкомолекулярные препараты в качестве средств лечения рака. Здесь мы используем комбинаторные возмущения CRISPR/Cas9, чтобы раскрыть обширную сеть функциональных взаимозависимостей между CDK и связанными с ними факторами, идентифицируя 43 синтетическо-летальных и 12 синергетических взаимодействий. Мы анализируем возмущения CDK с помощью одноклеточной RNAseq, для чего мы разрабатываем новую вычислительную структуру для точной количественной оценки эффектов клеточного цикла и различных состояний клеток, управляемых конкретными CDK. Хотя парное разрушение CDK4/6 является синтетически-летальным, только CDK6 необходим для нормального развития клеточного цикла и активации транскрипции. Множественные CDK (CDK1/7/9/12) являются синтетически летальными в сочетании с PRMT5 независимо от контроля клеточного цикла. Углубленный анализ экспрессии мРНК и паттернов сплайсинга предоставляет множество доказательств того, что зависимость CDK-PRMT5 обусловлена ​​аберрантной регуляцией транскрипции, приводящей к преждевременному терминированию. Эти взаимозависимости приводят к синергическому эффекту между лекарствами, что имеет терапевтические последствия при раке и других заболеваниях.

Регуляция и переход между фазами клеточного цикла осуществляются главным образом с помощью циклин-зависимых киназ (CDK) и связанных с ними циклиновых белков1. Семейство CDK велико и включает более 20 различных генов, кодирующих белки, и существует значительная неопределенность относительно конкретных функций отдельных членов семейства1,2. Канонически белки CDK делятся на два функциональных класса: факторы, регулирующие клеточный цикл, такие как CDK1, 2, 4 и 6, и факторы, участвующие в общем контроле транскрипции, такие как CDK7, 9 и 121 (рис. 1а, Расширенное дополнение (рис. 1). Транскрипционные CDK играют решающую роль в регуляции РНК-полимеразы II (RNAPII), выполняя разнообразные функции в процессе инициации, элонгации и терминации. Было показано, что CDK7,9 и 12 непосредственно фосфорилируют RNAPII. Однако все еще существует большая неопределенность относительно механической роли и функциональной важности каждого транскрипционного CDK. Например, CDK8 (работающий как часть медиаторного комплекса), как сообщается, является одновременно репрессором транскрипции и активатором, а CDK7 играет важную роль в инициации, кэпировании, проксимальной паузе между промотором и фосфорилировании CDK93,4. CDK9 необходим для элонгации транскрипции, при этом нокдаун CDK12 также приводит к глобальному нарушению транскрипции, особенно среди длинных генов, и генов реакции на повреждение ДНК1,5,6. Однако было показано, что многие CDK функционируют как в клеточном цикле, так и в транскрипционной роли, а также в различных других путях7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Например, белки как клеточного цикла, так и класса транскрипции могут активировать эпигенетические регуляторы EZH2, AR, PRMT5 и PARP111,17,18,19,20 или взаимодействовать с передачей сигналов пролиферативных клеток через путь трансформирующего фактора роста бета (TGFβ)21,22 . Складывающаяся картина такова, что CDK управляют сложной сетью перекрывающихся и синергических функций, при этом метки «клеточного цикла» и «транскрипции» предоставляют полезные, но неполные рекомендации.

Систематическое картирование функции гена CDK в тройных негативных клетках рака молочной железы. (а) Белки CDK контролируют развитие клеточного цикла и действуют как регуляторы транскрипции, вызывая интерес в качестве потенциальных мишеней для лекарств (цвета). (б) Схема, описывающая комбинаторный подход скрининга пригодности CRISPR/Cas9 для картирования синтетическо-летальных и синергических взаимодействий CDK. Библиотеку конструкций двойной sgRNA, нацеленных на пары генов, перечисленных в (a), синтезировали в виде пула олигонуклеотидов и клонировали в вектор сверхэкспрессии лентивирусов (вверху). Клеточные линии TNBC трансдуцировали вирусом, кодирующим эту библиотеку, и подвергали конкурентному скринингу роста. Полученные в результате приспособленности двойной конструкции sgRNA были использованы для извлечения значений приспособленности отдельных генов и картирования генетических взаимодействий. ( c ) Схема, описывающая подход к транскрипционному фенотипированию отдельных клеток для картирования функционального воздействия генетических нарушений CDK. Библиотеку sgRNA, нацеленную на гены, указанные в (a), клонировали в scRNA-seq-совместимый вектор сверхэкспрессии лентивирусов и использовали для трансдукции клеточных линий TNBC в объединенном формате. Через неделю после трансдукции проводили секРНК scRNA с использованием платформы 10x Chromium.